背景介紹

利用人血清白蛋白融合技術(shù),制備一種在體內(nèi)半衰期長,生物學(xué)活性高的長效研究重組人血清白蛋白.干擾素α2b融合蛋白,可用于病毒性肝炎,腫瘤等相關(guān)疾病的治療.重組人血清白蛋白‐干擾素α2b融合蛋白是一種新型、長效、具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，其半衰期較天然的干擾素α2b長且干擾素抗體的產(chǎn)生時(shí)間相對較晚，在臨床上對患者的耐受性及依從性都較天然的干擾素α好。目前一些公司的同類生物制品已經(jīng)進(jìn)行到Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段相應(yīng)的質(zhì)量控制方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)都有報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)使用的樣品為康寶集團(tuán)客戶提供的三個(gè)批次的重組人血清蛋白與干擾素α-2b融合蛋白樣品（編號：rIFNα-2b-HAS 20161101、 rIFNα-2b-HSA 20161102、 rIFNα-2b-HSA 20161203），主要進(jìn)行等電點(diǎn)的測定實(shí)驗(yàn)。

1.實(shí)驗(yàn)條件

儀器：LUMEX Capel 205 毛細(xì)管電泳儀

試劑：ADVANCED CIEF STARTER KIT試劑盒，Sciex 公司生產(chǎn)（試劑盒包含涂層的毛細(xì)管，pI 標(biāo)記物和CIEF凝膠）。

毛細(xì)管條件：長度42 cm，內(nèi)徑 50 um，特殊涂層。

分析波長：280 nm

分析電壓：25 kV

分析溫度：20℃

分析時(shí)間：70 min

實(shí)驗(yàn)試劑：蒸餾水、200 mM 磷酸、300 mM 氫氧化鈉、350 mM 乙酸、500 mM 精氨酸、200 mM 亞氨基二乙酸、3.75 M 尿素-Cief凝膠、尿素溶液和兩性電解質(zhì) (Pharmalyte® 3-10)。

2.實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先進(jìn)行毛細(xì)管的沖洗，對于本次使用的特殊的涂層毛細(xì)管不能用氫氧化鈉等緩沖液沖液，需要用水、凝膠進(jìn)行沖洗和活化。具體的試劑類型如下圖所示：       

進(jìn)口端和出口端溶液的放置

毛細(xì)管的潤洗和分析程序如下圖所示：

毛細(xì)管的潤洗程序

分析條件

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

按照上述分析條件進(jìn)行分析，在分析完成后會得到兩張譜圖，一張為聚焦的譜圖，一張為分析的譜圖，分析和定量主要是通過分析譜圖。在本次實(shí)驗(yàn)中主要采用了三種pI marker 5.5，9.5 和10進(jìn)行添加作為標(biāo)準(zhǔn)，對于*一批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161101，分析圖譜如下所示：

圖中35min 左右的峰為pI為9.5 的marker的峰，51min左右的峰為pI為7.0 的marker的峰, 61 min左右的峰為5.5的marker的峰。三個(gè)marker出峰都比較明顯，其中的第三個(gè)峰為樣品的峰，遷移時(shí)間約為56 min左右。

通過*一批次三個(gè)marker 的遷移時(shí)間和pI值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如下：

對于*一批的樣品，通過對樣品蛋白的積分，確定其保留時(shí)間并通過公式計(jì)算蛋白的pI值為6.05-6.14，其中大峰的pI值為6.05。

對于第二批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161102，分析圖譜如下所示：

圖中33min左右的峰為pI 為9.5的marker的峰，50min左右的峰為pI 為7.0 的marker的峰, 59min左右的峰為5.5的marker的峰。三個(gè)marker出峰都比較明顯，其中的第三個(gè)峰為樣品的峰，遷移時(shí)間約為55 min左右。

通過第二批次三個(gè)marker 的遷移時(shí)間和pI值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如下：

對于第二批的樣品，通過對樣品蛋白的積分，確定其保留時(shí)間（54.6、55、55.4 min）并通過公式計(jì)算蛋白的pI值為6.02-6.15，其中大峰的pI值為6.02。

對于第三批次的樣品rIFNα-2b-HAS 20161203，分析圖譜如下所示：

圖中34 min 左右的峰為pI 為9.5 的marker的峰，51 min 左右的峰為pI 為7.0 的marker的峰, 60 min左右的峰為5.5的marker的峰。三個(gè)marker出峰都比較明顯，其中的第三個(gè)峰為樣品的峰，遷移時(shí)間約為55 min左右。

通過第二批次三個(gè)marker 的遷移時(shí)間和pI值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如下：

對于第三批的樣品，通過對樣品蛋白的積分，確定其保留時(shí)間（56.5、56.9、57.3 min）并通過公式計(jì)算蛋白的pI值為6.03-6.15，其中大峰的pI值為6.03。

為了確認(rèn)是否在5.5與4.1之間是否有其他的蛋白，將5種標(biāo)記物都配制走樣，圖譜如下：

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在此條件下未出現(xiàn)明顯的其他雜質(zhì)蛋白，說明蛋白相對較純。